Презентация. Маркерная селекция

Скачать презентацию




Лекция 11 Селекция с использованием молекулярных маркеров
 


Селекция с помощью маркеров (СПМ) — это метод отбора, который играет все более важную роль в программах селекции сельскохозяйственных культур. СПМ позволяет быстро отобрать большое количество растений на раннем этапе процесса селекции, в результате чего для внедрения новых сортов может потребоваться гораздо меньше времени: работу по выведению каждого нового сорта сельскохозяйственных культур можно сократить на несколько лет.
 


Молекулярные маркеры — это небольшие сегменты ДНК, которые расположены в непосредственной близости от гена (или нескольких генов) в ДНК растения, придающего/-их растению желаемое свойство — например, бoльшую засухоустойчивость, — которое селекционер хочет сформировать у нового сорта сельскохозяйственной культуры. Анализ небольшого фрагмента ткани растения, например, взятого из посева нового его генотипа, в отношении которой проводится отбор, при использовании маркеров в качестве индикаторов («флагов») позволяет селекционеру понять, имеется ли желаемый ген в новом растении. Если такой ген отсутствует, селекционер может сразу же перейти к анализу следующего растения.
 


Молекулярно-генетические маркеры (МГМ) полиморфизма различных участков ДНК 1) полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP); 2) микросателлитных локусов (SSR); 3) длин анонимных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами случайных декануклеотидов (RAPD), 4) последовательностей микросателлитов (ISSR), 5) терминальных участков ретротранспозонов (IRAP)
 


F2 P2 F1 P1 x Большая популяция из нескольких тысяч растений Отбор по фенотипу Полевые испытания Испытание в теплице Донор Реципиент Традиционная селекция растений Отбор на солонцеустойчивость в фитотроне Отбор по устойчивости к бактериозу Участок с дефицитом фосфора
 


F2 P2 F1 P1 x Большая популяция из нескольких тысяч растений Устойчивый сорт Восприимчивый сорт Селекция с помощью маркеров
 


Благодаря открытию геномного полиморфизма генетики получили широкие возможности для картирования генов, т.е. локализации генов на хромосомах. Распределенные по всему геному, полиморфизмы используются как генетические маркеры. Генетическими маркерами называются участки ДНК с известной локализацией и множественными аллельными формами. Они служат опорными точками для картирования генов.
 


Локусы количественных признаков (ЛКП) - это полигенные системы, обеспечивающие непрерывную вариативность признака в популяции. Целью картирования ЛКП является поиск не единичного гена, а групп генов, принимающих участие в формировании популяционной вариативности по количественному признаку. Метод картирования ЛКП эффективен для выявления эффектов главных генов, вносящих основной вклад в формирование количественного признака.
 


Генетическая карта хромосом ячменя
 


 
 


Генетическая карта популяции ячменя с 343 молекулярными маркерами с указанием QTLs по вегетационному периоду (HD), высоте растений (PH), длине плодоножки (PL), числу побегов (TN) и устойчивости к полосатой ржавчине (SR). Вертикальная черта и символы представляют интервал доверия и оценки максимального значения Lod (аббревиатура от logarifm of the odds ratio - логарифм отношения шанса (правдоподобия) сцепления двух локусов к шансу (правдоподобию) отсутствия сцепления) соответственно для различных QTLs где Z – величина LOD балла; P(F|?) — правдоподобие первой гипотезы; a P(F|l/2) - правдоподобие второй гипотезы
 


где r — наблюдаемое число рекомбинаций, a n- число информативных мейозов. Правдоподобие каждой из гипотез рассчитывается по формулам: где X - генетическое расстояние в сМ, а ? (тета)- доля рекомбинаций
 


Передача QTL локусов с помощью маркеров
 


 
 


 
 


(1) Взятие образцов тканей листа (2) Извлечение ДНК (3) ПЦР (4) Гель электрофорез (5) Анализ маркеров
 


Электрофорез в агарозном геле UV transilluminator УФ-трансиллюминатор
 


PCR (polymerase chain reaction) — полимеразная цепная реакция (ПЦР) заключается в избирательном синтезе in vitro большого числа (порядка млн.) копий небольшого размера матричной ДНК размером от 5 до нескольких тысяч нуклеотидов; при некоторых условиях возможна амплификация более крупных размеров (до 35 тыс. п. о.). Метод амплификации in vitro с помощью ДНК-полимеразы нуклеотидных последовательностей с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся реакций (20—30 циклов) — денатурация ДНК, отжиг ДНК-затравок и синтез ДНК с каждой из затравок навстречу друг другу с использованием противоположных цепей ДНК в качестве матриц.
 


По завершении каждого цикла количество синтезируемого продукта удваивается и происходит увеличение количества анализируемой последовательности. ПЦР позволяет амплифицировать любые последовательности, что делает возможным использовать её для секвенирования, молекулярной ДНК диагностики, картирования генов и др.
 


Синтезированные в ходе ПЦР продукты — молекулярные копии полиморфных участков геномной ДНК — накапливаются в реакционной смеси, вследствие чего количественно оказываются доступными для сравнительного анализа. Для этого полученные амплификационные продукты фракционируют по длине с помощью электрофореза в геле агарозы или полиакриламида и фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции, выявляют различными методами детекции. Чаще всего на электрофореграмме визуализируют полосы (зоны локализации фрагментов ДНК одного размера) с помощью флюоресцентного красителя этидиумбромида и затем регистрируют фотографически в УФ-свете или путем окрашивания нитратом серебра (в акриламидных гелях) с последующей фиксацией и высушиванием геля.
 


Индивидуальность ДНК реализуется в виде индивидуально-специфичной комбинации из двух полиморфных фрагментов (полос на электрофореграмме), характеризующихся определенным расположением на дорожке геля. Это так называемый амплификационный профиль ДНК, который и является индивидуализируюшей геномной характеристикой растения, которому принадлежит анализируемая ДНК. С целью отождествления амплификационных профилей ДНК или выявления в них признаков сходства и различий проводят их позиционное сопоставление. При анализе электрофореграммы можно выделить два аспекта: а) картины распределения полос на сравниваемых дорожках геля похожи или непохожи; б) позиции соответствующих фрагментов совпадают или не совпадают.
 


Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
 


В ИЦиГ СО РАН (Новосибирск) на основе коллекции микросателлитных маркеров впервые проведено картирование гена чувствительности на яровизацию Vrn B1 на 5В-хромосоме мягкой пшеницы. Показано, что наиболее вероятное расположение данного гена — в области локализации микросателлитного маркера WMS408. Полученные результаты позволяют рассматривать микросателлитные маркеры, расположенные на 5В хромосоме, как эффективный инструмент современной селекции для создания новых форм пшеницы с яровым образом жизни. Молекулярные маркеры в селекции на скороспелость, высокое качество зерна, устойчивость к болезням
 


Локализация признака Vrn B1 на 5В хромосоме методом интервального анализа. Номера микросателлитных маркеров указаны на оси ординат справа. На оси абсцисс приведены значения критерия сцепления (LOD).
 


На основе разработанных методов хромосомной инженерии созданы иммунные линии сорта мягкой пшеницы Саратовская 29. Эти линии являются донорами генов, контролирующих высокое содержание белка в зерне и устойчивость к листовым патогенам – мучнистой росе и бурой ржавчине. Гены, контролирующие высокое содержание белка в зерне и адаптивные признаки перенесены от дикорастущих сородичей пшеницы – T. timopheevii (GGAtAt) и T.tauschii (D’D’). Генотипирование иммунных линий с использованием молекулярных маркеров выявило, что их хромосомы являются рекомбинантными за счет включения сегментов хромосом дикорастущих сородичей пшеницы в геном мягкой пшеницы. Иммунные линии включены в селекционный процесс и на их основе получены перспективные гибридные формы – кандидаты для получения новых сортов яровой мягкой пшеницы.
 


 
 


 
 


Микросателлитный геномный паспорт сорта На основании результатов генотипирования 60 отечественных сортов пшеницы с помощью микросателлиных маркеров (от 19 до 210 маркеров на сорт) разработан вариант микросателлитного геномного паспорта. Индивидуальный паспорт каждого сорта включает в себя информацию о длине микросателлитных локусов. Геномная дактилоскопия, основанная на анализе сочетания микросателлитных локусов, может использоваться для охраны авторских прав, сертификации семян и контроля сортового и коллекционного материала злаковых культур.
 


 
 


 
 


 
 


Метод геномной дактилоскопии сортового материала пшеницы с использованием микросателлитных маркеров состоит из нескольких этапов. 1. Выделение геномной ДНК из 5-10 индивидуальных растений каждого сорта. 2. Выбор праймеров к микросателлитным областям пшеницы (от 2 до 4 на хромосому) на основании литературных данных и собственного опыта работа с данным типом маркеров. 3. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с каждым индивидуальным растением и с каждой парой праймеров к микросателлитным районам. 4. Проведение гелевого электрофореза с продуктами ПЦР для определения длины индивидуального микросателлитного локуса.
 


5. Интерпретация полученных результатов относительно базы данных по этим маркерам. 6. Составления паспорта сорта по данным геномной дактилоскопии.
 


Различают варьирующие по числу (длинные) тандемные повторы ( минисателлитная ДНК ) и короткие (тетра-, три-, ди- или мононуклеотидные) тандемные повторы (микросателлитная ДНК). Микросателлиты (SSR — Simple Sequence Repeats), - последовательности состоящие из многократно повторяющегося элемента (мотива), например ди-, три-, тетрануклеотида: (NN-N)n. n - число повторов данного мотива. Микросателлиты более или менее случайно разбросаны по геному. Они проявляют заметную нестабильность и могут мутировать изменяя число n. Праймер (primer) — это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК-полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут только наращивать существующую цепь. Полимеразы начинают репликацию с 3'-конца праймера, и создают копию другой цепи.
 


Многие лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии, которые предполагают использование ДНК-полимеразы, такие, как секвенирование или полимеразная цепная реакция, требуют наличие праймеров. Такие праймеры обычно короткие, химически синтезированные олигонуклеотиды, длиной порядка двадцати оснований. Они гибридизуются с ДНК-мишенью, которая затем копируется полимеразой.
 


Маркер RB гена устойчивости к фитофторозу из Solanum bulbocastanum. 1– Отр. контроль, 2, 7, 10, 11 – S. tuberosum; 3 – S. bulbocastanum; 4-6, 8, 9 – гибриды S. bulbocastanum (+) S. tuberosum; M – маркер мол. массы Перенос R генов устойчивости к фитофторозу из дикорастущих сородичей в картофель. Важное место в селекции картофеля занимает создание долговременной устойчивости к фитофторозу. Технология ДНК маркеров позволяет ускорить поиск новых генов и источников долговременной устойчивости у ранее не исследованных дикорастущих сородичей картофеля. ВНИИСБ и ВНИИКХ: Идентификация генотипов с помощью молекулярных маркёров
 

< <       > >